آزمون سمیت سلولی (Cytotoxicity Test)
آزمون سمیت سلولی یکی از مهم‌ترین ارکان زیست‌سازگاری (Biocompatibility) است که اثرات مضر بالقوه‌ی یک ماده/محصول را بر سلول‌های زنده ارزیابی می‌کند. این آزمون در داروسازی، تجهیزات پزشکی، دندانی، بیوتکنولوژی و مهندسی بافت برای اطمینان از ایمنی و سازگاری به‌صورت گسترده به‌کار می‌رود.
1.استاندارد مرجع: ISO 10993-5 (ارزیابی سمیت سلولی)
2.الزامات آماده‌سازی/استخراج: ISO 10993-12
رویکردهای آزمون طبق ISO 10993-5
سه قالب پایه برای تماس «نمونه/سلول» تعریف می‌شود:
1.آزمون عصاره (Extract Test)
مواد در حلال‌های استاندارد (آبی/آلی سازگار) و شرایط کنترل‌شده (زمان، دما، نسبت سطح به حجم) استخراج و عصاره به سلول‌ها افزوده می‌شود.
مناسب: دستگاه‌های با فرم پیچیده یا در تماس غیرمستقیم با بافت.
2.تماس مستقیم (Direct Contact)
قطعه‌ی نمونه مستقیماً روی تک‌لایه‌ی سلولی قرار می‌گیرد. هرگونه دژنراسیون/لیز سلولی اطراف نمونه ارزیابی می‌شود.
مناسب: فیلم‌ها/پوشش‌ها/پودرهای کم‌مهاجرت.
3.تماس غیرمستقیم (Indirect Contact) – سد فیزیکی
نمونه و سلول با غشای نفوذپذیر/آگار از هم جدا می‌شوند تا فقط مواد مهاجر به سلول برسند.
مناسب: وقتی تماس مستقیم باعث آرتیفکت مکانیکی می‌شود.
کنترل‌ها: کنترل مثبت (ماده سمی شناخته‌شده) و کنترل منفی (بی‌اثر) برای اعتبارسنجی نتایج ضروری‌اند.
سنجش‌های کمی پرکاربرد (Endpoints)
MTT/XTT/WST-1 (تترازولیوم): سنجش فعالیت میتوکندری و بقای سلولی
AlamarBlue/Resazurin: شاخص متابولیک قابل‌خوانش فلورسانس
ATP/CellTiter-Glo: اندازه‌گیری ATP به‌عنوان مارکر حیات سلولی (حساس و HTS-friendly)
LDH Release: نشت LDH به محیط به‌عنوان شاخص آسیب غشا
Neutral Red Uptake (NRU): جذب رنگ در لیزوزوم سلول‌های زنده
Trypan Blue Exclusion: شمارش دستی سلول‌های مرده/زنده (ساده، کم‌هزینه)
Flow Cytometry (Annexin V/PI): تمایز آپوپتوز/نکروز و تغییرات غشایی
RTCA/Impedance (xCELLigence): پایش زنده و زمانی چسبندگی/بقا بدون رنگ‌سنجی
نکته: آزمون Comet و میکرونوکلئوس شاخص‌های سمیت ژنی هستند (ISO 10993-3) و مکمل سمیت سلولی‌اند، نه جایگزین آن.
طراحی آزمون و معیارهای کلیدی
خط سلولی: L929 (مرجع رایج)، فیبروبلاست/کراتینوسیت/سلول‌های هدف کاربرد
شرایط کشت: 37°C، 5% CO₂، محیط مناسب (DMEM/RPMI + FBS)
طراحی دوز: سری غلظتی (حداقل 6–8 نقطه) برای منحنی دوز–پاسخ و محاسبه IC₅₀
زمان مواجهه: معمولاً 24–72 ساعت متناسب با رشد/کاربرد
خنثی‌سازی تداخلات: اصلاح pH/رنگ/کدورت و نوترینالیزاسیون در صورت وجود مواد مداخله‌گر
تکرارپذیری: تکرارهای بیولوژیک و فنی + آمار (میانگین±SD، آزمون‌های مناسب)
محاسبات رایج
درصد بقا (% Viability) = (سیگنال نمونه / سیگنال کنترل منفی) × 100
IC₅₀: غلظتی که 50٪ کاهش بقا را ایجاد می‌کند (برازش لجستیک چهارپارامتری)
نمره‌گذاری واکنش (Direct/Indirect)
در تماس مستقیم/غیرمستقیم، تغییرات مورفولوژیک در مقیاس 0 تا 4 رتبه‌بندی می‌شود.
قبولی معمول: واکنش ≤ درجه 2 (خفیف)
روند اجرایی استاندارد
استخراج/تهیه نمونه طبق ISO 10993-12 (حلال، زمان، دما، S/V)
بذرگذاری سلول‌ها با تراکم مناسب و رسیدن به یکنواختی رشد
تیمار (عصاره/تماس مستقیم/غیرمستقیم) در سری غلظتی
انکوباسیون 24–72 ساعت (با پایش آلودگی/پایداری)
خوانش اندپوینت (MTT/ATP/LDH/…)، تصویربرداری و ثبت مورفولوژی
تحلیل آماری، محاسبه %Viability/IC₅₀، مقایسه با کنترل‌ها و معیار قبولی
گزارش نهایی: پروتکل، مواد/روش‌ها، داده خام و پردازش‌شده، نمودار دوز–پاسخ، نتیجه‌گیری Pass/Fail
چه زمانی این آزمون الزامی است؟
تقریباً برای اکثر دستگاه‌های پزشکی مطابق ISO 10993-1 (بسته به نوع تماس/مدت)
در توسعه فرمولاسیون (انتخاب مواد، افزودنی‌ها، پوشش‌ها)
هنگام تغییر منبع ماده اولیه/فرایند/استریل‌سازی
برای تأییدیه‌های رگولاتوری و پرونده‌های ثبت محصول
خروجی گزارش (Regulatory-Ready)
استانداردها و نسخه‌ها (ISO 10993-5/12، شرایط استخراج)
نوع تماس (Extract/Direct/Indirect)، خط سلولی، زمان مواجهه
اندپوینت‌ها (MTT/ATP/LDH/…)، منحنی‌های دوز–پاسخ، IC₅₀
تصاویر میکروسکوپی/نمره‌گذاری واکنش (0–4)
آمار و تفسیر + نتیجه قبولی/رد طبق معیار استاندارد
بحث مداخلات احتمالی ماتریکس و محدودیت‌ها
نکات کاربردی و حرفه‌ای
هم‌تراز کردن ادعا با اندپوینت: اگر تمرکز بر viability است، MTT/ATP اولویت دارد؛ اگر آسیب غشا مهم است، LDH گویاست.
مواد با رنگ/کدورت/فلورسنس ذاتی می‌توانند نتایج را مخدوش کنند؛ استفاده از اندپوینت‌های جایگزین (ATP/RTCA) یا کماینیشن چنداندپوینتی پیشنهاد می‌شود.
RTCA ارزش افزوده‌ی مهمی برای مشاهده‌ی دینامیک اثر (تاخیر، ریکاوری، برگشت‌پذیری) دارد.
Persian 
English 
Arabic