آزمون تشخیص مایکوپلاسما (PCR)؛ روش دقیق و سریع پایش آلودگی مایکوپلاسما
مایکوپلاسما چیست و چرا اهمیت دارد؟
مایکوپلاسماها گروهی از باکتری‌های بسیار کوچک و فاقد دیواره سلولی هستند که به‌دلیل همین ویژگی، به‌طور ذاتی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مؤثر بر دیواره سلولی مانند پنی‌سیلین‌ها مقاوم‌اند. این میکروارگانیسم‌ها رشد آهسته‌ای در کشت‌های معمول دارند و اغلب بدون ایجاد کدورت یا تغییرات ظاهری، به‌صورت پنهان در محیط‌های کشت سلولی باقی می‌مانند. آلودگی مایکوپلاسما می‌تواند رشد سلول‌ها، بیان ژن، متابولیسم و نتایج آزمایشگاهی را به‌شدت تحت تأثیر قرار دهد و منجر به داده‌های غیرقابل اعتماد شود. به همین دلیل، تشخیص مایکوپلاسما یکی از مهم‌ترین اقدامات کنترلی در آزمایشگاه‌های کشت سلولی و صنایع زیستی محسوب می‌شود.
چرا پایش و تشخیص مایکوپلاسما به‌صورت مداوم ضروری است؟
در تولید فرآورده‌های زیستی، واکسن‌ها، محصولات بیولوژیک و همچنین در کار با رده‌های سلولی تحقیقاتی و صنعتی، ریسک آلودگی مایکوپلاسما همواره وجود دارد. این آلودگی می‌تواند از طریق مواد خام زیستی، سرم‌ها، محیط‌های کشت یا حتی رفتارهای آسپتیک نامناسب وارد سیستم شود. به همین دلیل، پایش مداوم و برنامه‌ریزی‌شده تشخیص مایکوپلاسما طبق استانداردهای مرجع بین‌المللی مانند Ph. Eur. 2.6.7، USP و راهنماهای ICH، به‌عنوان بخشی از سیستم کنترل کیفیت الزامی یا به‌شدت توصیه می‌شود.
روش‌های متداول آزمون تشخیص مایکوپلاسما
برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما، روش‌های مختلفی وجود دارد که هرکدام کاربرد و محدودیت‌های خاص خود را دارند.
PCR اختصاصی مایکوپلاسما
آزمون PCR یکی از رایج‌ترین و مؤثرترین روش‌ها برای تشخیص مایکوپلاسما است. در این روش، DNA مایکوپلاسما و آکلوپلاسما با استفاده از پرایمرهای اختصاصی شناسایی می‌شود. PCR به‌دلیل حساسیت و اختصاصیت بالا، برای غربالگری روتین کشت‌های سلولی بسیار مناسب است. لازم به ذکر است که PCR وجود DNA را نشان می‌دهد و افتراق زنده یا مرده بودن ارگانیسم، بسته به الزامات مقرراتی، نیازمند تفسیر تکمیلی است.
کشت اختصاصی مایکوپلاسما
روش کشت، مرجع تشخیصی برای اثبات زیستایی مایکوپلاسما محسوب می‌شود، اما زمان‌بر بوده و معمولاً چندین روز تا چند هفته طول می‌کشد. به همین دلیل، بیشتر به‌عنوان روش تأییدی پس از تشخیص مولکولی استفاده می‌شود.
رنگ‌آمیزی فلورسنت (DAPI/Hoechst)
این روش یک آزمون کمکی و کیفی است که برای بررسی سریع آلودگی در کشت‌های سلولی کاربرد دارد، اما به‌تنهایی برای تصمیم‌گیری‌های رگولاتوری کافی نیست.
مزایای آزمون PCR در تشخیص مایکوپلاسما
آزمون PCR برای تشخیص مایکوپلاسما مزایای متعددی دارد. این روش دارای حساسیت و اختصاصیت بالا بوده و گونه‌های شایع آلاینده را که مسئول اکثریت آلودگی‌های گزارش‌شده هستند پوشش می‌دهد. زمان پاسخ کوتاه PCR امکان تصمیم‌گیری سریع در خصوص ادامه کار با رده سلولی یا قرنطینه آن را فراهم می‌کند. همچنین این روش برای پایش دوره‌ای خطوط سلولی و مواد اولیه زیستی کاملاً مناسب است.
نمونه‌برداری و شرایط انجام آزمون
نمونه‌های قابل قبول برای تشخیص مایکوپلاسما شامل سوپرانانت کشت سلولی، پلت سلولی، محیط کشت مصرف‌شده یا کنترل و برخی مواد خام زیستی منتخب است. حجم پیشنهادی نمونه بسته به ماتریس متفاوت بوده و معمولاً ۱ تا ۲ میلی‌لیتر سوپرانانت یا حدود ۱۰⁶ تا ۱۰⁷ سلول توصیه می‌شود. نمونه‌ها باید در شرایط سرد (۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد) حمل و نگهداری شده و از چرخه‌های انجماد و ذوب مکرر اجتناب شود. ارائه اطلاعاتی مانند منشأ رده سلولی، آنتی‌بیوتیک‌های مصرفی و زمان آخرین تعویض محیط نیز برای تفسیر صحیح نتایج ضروری است.
گزارش‌دهی، تفسیر و محدودیت‌ها
نتیجه آزمون PCR به‌صورت «مثبت» یا «منفی» همراه با کنترل‌های کیفی و کنترل داخلی استخراج و تکثیر گزارش می‌شود. در صورت مثبت بودن نتیجه، بسته به الزامات مقرراتی، انجام کشت تأییدی برای بررسی زیستایی توصیه می‌گردد. حد تشخیص (LOD) بر اساس اعتبارسنجی داخلی روش اعلام می‌شود. وجود بازدارنده‌های PCR، DNA غیرزنده یا بار آلودگی بسیار پایین از جمله محدودیت‌های این روش هستند و در چنین مواردی، تکرار آزمون طبق SOP پیشنهاد می‌شود.
بسامد پیشنهادی پایش تشخیص مایکوپلاسما
در کشت‌های سلولی روتین، انجام آزمون تشخیص مایکوپلاسما هر ۴ تا ۶ هفته یک‌بار یا پیش از ارسال و به‌اشتراک‌گذاری رده‌ها توصیه می‌شود. در تولیدات زیستی و واکسنی، بسامد آزمون باید بر اساس طرح کنترل کیفیت و الزامات پرونده مقرراتی تعیین گردد.
Persian 
English 
Arabic